آب داغ مایعتوانایی حذف حدود ۸۰ درصد همیسلولز موجود در خوراک و لیگنینزدایی جزئیمیزان بالای انرژی مورد نیاز، مصرف آب بالا
انفجار بخارایجاد جابجایی در لیگنین و انحلالپذیری در همیسلولز، قیمت مناسب، بازدهی بالاتر در گلوکز و همیسلولز، استفاده مناسب از مواد خام اولیهتولید ذرات سمی، تجزیه جزئی همیسلولزبیولوژیکیتجزیه لیگنین و همیسلولز، انرژی مصرفی پائین، شرایط محیطی ملایم، عدم تأثیرات منفی بر محیط زیستنرخ پایین میزان پیشتیمار، فضای زیاد مورد نیاز جهت انجام پیشتیمار
هیدروکسیدسدیم، هیدروکسیدپتاسیم، هیدروکسیدکلسیم و هیدروکسیدآمونیوم از عوامل مناسب برای پیشتیمار قلیایی میباشند. مطالعات مختلف نشان داد که در میان این عوامل، هیدروکسیدسدیم بیشترین کاربرد در پیشتیمار قلیایی را داشت. با این حال، هیدروکسیدکلسیم نیز به عنوان یک عامل پیشتیمار مؤثر و کمهزینه شناخته شده است ]۴۰,۳۹[. مطالعات متعددی برای بررسی پتانسیل پیشتیمار قلیایی و اسیدی بر روی مواد لیگنوسلولزی مختلف انجام شده است.
Rodriguez و همکاران (۱۹۹۳) با بهره گرفتن از گونه سلولوموناس به تولید پروتئین تک یاخته پرداختند. سوبسترا در این تحقیق تفاله نیشکر بوده که محلول NaOH ۰/۲ و ۰/۴ مولاربرای پیش تیمار سوبسترا مورد استفاده قرار گرفت. پیش تیمار در دماهای ۳۰، ۵۵ و۸۰ و در زمان های۱۰، ۳۰ و ۶۰ دقیقه انجام شد. آن ها همچنین پیش تیمار در دمای محیط را انجام دادند و بهترین نتیجه در مدت ۴ ساعت بدست آمد ]۴۱[. در آزمایش دیگری از آن ها محلول NaOH (۱۰%) برای مدت ۱ ساعت در دمای ۱۸۰ درجه سانتی گراد روی باگاس نیشکر برای بدست آوردن بازدهی بالا استفاده شده است. در این تحقیق نیز میکروارگانیسم مورد استفاده سلولوموناس بوده است ]۴۲[.
Molina و همکاران (۱۹۸۴، ۱۹۸۰، ۱۹۸۳) بوسیله پیش تیمار باگاس با محلول NaOH (۱۰%) در دمای اتاق به تولید پروتئین تک یاخته پرداختند. بیشترین میزان پروتئین در دمای ۲۵ درجه سانتی گراد به مدت ۲۴ ساعت حاصل شد. محیط کشت مخلوط از باکتری های سلولوموناس و باسیلوس سوبتیلیس[۶۲] برای این آزمایش مورد استفاده قرار گرفت. نتایج نشان داد میزان سلولز و همی سلولز قبل و بعد از پیش تیمار در تفاله نیشکر تغییری نکرد اما میزان لیگنین به میزان ۳۳% بعد از پیش تیمار کاهش یافت.آنها همچنین در تحقیق دیگری به لیگنین زدایی باگاس با بهره گرفتن از NaOH (۱%) در دمای ۱۰۰ درجه سانتی گراد به مدت ۳۰ دقیقه پرداختند. با بهره گرفتن از این روش میزان کاهش وزن خشک ۵۰% و میزان فعالیت سلولتیکی (بیانگر میزان سلولز مصرف شده به سلولز ورودی) ۷۰% گزارش شده است و میزان تولید پروتئین ۸/۷ گرم بر لیتر و پروتئین خالص به ازای سوبسترای هیدرولیز شده ۲۲% به دست آمد ]۴۴,۴۳,۳۳[.
Nesse و همکارانش (۱۹۷۷) گزارش دادند در صورت استفاده از بخار به عنوان پیش تیمار دراتوکلاو با دمای ۲۰۰-۱۳۰ درجه سانتی گراد به مدت ۵ دقیقه، توانایی سلولاز برای مصرف سلولز کود حیوانی با بهره گرفتن از آسپرژیلوس نایجر، ۱۰ تا ۱۲ برابر افزایش می یابد. اما این مقدار برای زمانی که از NaOH (۱%) برای مدت ۱ ساعت در دمای اتاق استفاده شد ۶ برابر گزارش شده است ]۴۵[.
Han و Callihan (۱۹۷۴) پیش تیمار اسیدی، قلیایی و آنزیمی و ترکیبات اکسیدکننده را بر روی باگاس به عنوان یک منبع سلولزی امتحان کردند. محیط کشت مورد استفاده در این کار محیط کشت مخلوط سلولوموناس و آلکالیجنس فیکالیس[۶۳] بود. تمرکز اصلی در این تحقیق بررسی غلظت های مختلف محلول NaOH و زمان های متفاوت برای پیش تیمار گزارش شده است که استفاده از NaOH (۳%) در فشار ۲۶۰psi به مدت ۵ دقیقه در دمای اتاق بهترین نتیجه را حاصل کرده است. آن ها همچنین قابلیت هضم باگاس را در نسبت های مختلفNaOH نشان دادند ]۴۶[.
Linko (۱۹۷۷) نشان داد که استفاده از محلول NaOH با غلظت پایین و زمان کوتاه باعث تورم فیبرهای سلولزی شده که نتایج بدست آمده به خوبیزمانی بود که این فیبرها با روش های دیگر ساختار کریستالی خود را از دست دادند. او اظهار داشت که پیش تیمار طولانی سبب کاهش وزن خشک به دلیل لیگنین و همی سلولز غیرقابل حل می شود ]۴۷[.
El-shawarby (۱۹۸۶) در یک فرایند نیمه صنعتی از باگاس نیشکر برای تولید پروتئین تک یاخته استفاده کردند. میکروارگانیسم مورد استفاده در این فرایند تریکودرما ویریدی[۶۴] بوده است. باگاس با بهره گرفتن از NaOH (۱%) به مدت ۸ ساعت پیش تیمار شد. مدت زمان تخمیر ۲۸ روز و میزان پروتئین حاصل ۲۸% گزارش شد ]۴۸[.
۲-۴-۲- تخمیر
به طور کلی تولید توده زیستی میکروبی از دو روش تخمیر حالت غوطه ور و یا تخمیر حالت جامد انجام می شود. انتخاب نوع روش تخمیر تا حد زیادی به نوع سوبسترا، محصولات و بازدهی بستگی دارد. پس از تخمیر، توده زیستی استخراج شده و به عنوان منبع پروتئین مورد استفاده قرار می گیرد یا تحت فرایند های پایین دستی قرار می گیرد ]۴۹,۲[.
۲-۴-۲-۱- تخمیر حالت غوطه ور
در این نوع از تخمیر، محیط کشت به صورت محلول، امولوسیون و یا سوسپانسیون درون محیط آبی قرار دارد و سوبسترا همیشه در مایعی که شامل مواد مغذی برای رشد است تخمیر می شود. در این حالت سوبسترا در بیورآکتوری نگه داشته می شود که بطور پیوسته، نیمه پیوسته و ناپیوسته کار می کند و زمانی که توده زیستی تولید شد با روش های گوناگون استخراج می شود. محصول به دست آمده فیلتر یا سانتریفیوژ شده و سپس خشک می شود. در تخمیر حالت غوطه ور اندازه گیری پارامترهای فرایند ساده تر بوده و میکروارگانیسم ها در محیط کشت به صورت یکنواخت توزیع می شوند. عدم وجود مشکل کمبود رطوبت به دلیل حجم بالای آب از مزایای این نوع تخمیر است. تخمیر حالت غوطه ور سرمایه بیشتر و هزینه عملیاتی بالاتری نسبت به تخمیر حالت جامد دارد، با این وجود دارای بازده پروتئینی پایین تری است. محیط کشت شامل چندین پارامتر مهندسی شامل هم زدن، اختلاط سیستم های چند فازی (گاز، مایع، جامد)، انتقال اکسیژن از حباب های گاز به فاز مایع برای استفاده میکروارگانیسم ها و انتقال حرارت از فاز مایع به محیط اطراف است. هوادهی یک عملیات بسیار مهم در کشت است. حرارت عموما در طول کشت تولید می شود و می توان بوسیله دستگاه های خنک کننده آن را خارج کرد ]۴۹[.
۲-۴-۲-۲- تخمیر حالت جامد
تخمیر حالت جامد به معنی رشد میکروارگانیسم ها بر روی سوبسترای جامد بدون حضور آب آزاد است. با این حال، سوبسترا باید دارای رطوبت کافی برای رشد میکروارگانیسم ها باشد. فعالیت آبی سوبسترا در این نوع تخمیر مهم است. درتخمیر حالت جامد آب بسیار کم است و میکروارگانیسم ها برخلاف تخمیر غوطه ور به طور نزدیک در تماس با اکسیژن موجود در هوا هستند. این نوع تخمیر آسان تر بوده و انرژی مورد نیاز کمتری در مقایسه با حالت غوطه ور می خواهد. حجم پایین آب موجود باعث کاهش فضای اشغال شده بوسیله بیورآکتور شده، بدون اینکه بازده محصول را کاهش دهد. هوادهی و همزدن راحت تر است. یکی از جنبه های منفی SSF کندتر بودن آن نسبت به تخمیر غوطه ور است. SSF از هزاران سال قبل برای آماده سازی غذاهای محلی در کشورهای شرقی و نان، ماست و پنیر در کشورهای غربی استفاده می شد. همچنین امروزه در تولید برخی محصولات کاربرد دارد. تخمیر حالت جامد در زمینه تولید آنزیم ها، آنتی بیوتیک ها، فعال کننده های سطحی و غیره کاربرد دارد. هم چنین برای تولید محصولات با ارزش افزوده از ضایعات استفاده می شود ]۵۱,۵۰[. عموماً این نوع تخمیر برای تولید غذاهای تخمیر شده نظیر محصولات لبنی، سس سویا و ذرت تخمیر شده استفاده می شود ]۵۲[.
به طورکلی چندین جنبه مهم باید در هر فرایند بیولوژیکی درSSF مورد توجه قرار گیرد. این موارد شامل انتخاب میکروارگانیسم و سوبسترای مناسب، بهینه کردن پارامترهای فرایند، ایزوله کردن و خالص سازی محصول است.
بسیاری از انواع میکروارگانیسم ها توانایی رشد بر سوبستراهای جامد را دارند بنابراین می توانند در تخمیر حالت جامد استفاده شوند. قارچ، مخمر، برخی از باکتری ها و ترکیب آن ها می توانند مورد استفاده قرار بگیرند اما تنها قارچ های رشته ای می توانند به طور قابل ملاحظه ای در حالت بدون آب رشد کنند. باکتری ها و مخمرها بر روی سوبستراهای جامد با سطح رطوبت ۷۰-۴۰ درصد رشد می کنند ]۵۲,۵۱[. بر مبنای تئوری و بر پایه فعالیت آبی، تنها قارچ ها و مخمرها میکروارگانیسم های مناسب برایSSF هستند. محیط کشت SSF برای باکتری مناسب نیست اما با این حال تحقیقاتی در این زمینه انجام گرفته است ]۵۰[.
بسیاری از سوبستراهای جامد می توانند برای SSF مورد استفاده قرار بگیرند که از جمله آن ها ضایعات کشاورزی می باشند. در بین این ضایعات مواد سلولزی هم می توانند مورد استفاده قرار گیرند بدون اینکه نیاز به فرایند های پیش تیمار هزینه بر داشته باشند. زیرا محصولات SSF محلول نیستند و آسان تر از محصولات تولید شده در تخمیر غوطه ور بازیابی می شوند ]۵۲[.
تخریب سوبسترا در تخمیر حالت جامد تنها متأثر از کیفیت نیست بلکه تحت تأثیر اندازه ذرات نیز هست. ذرات با اندازه کوچک تخلخل را کاهش داده و باعث پایین آمدن نفوذ گاز می شود. در حالی که ذرات بزرگ رطوبت کندتری جذب می کنند و کمتر متورم می شوند بنابراین با خشک شدن سریع باعث رشد بهینه میکروارگانیسم می شوند. با افزایش سایز ذرات سوبسترا، سطح قابل دسترس کاهش خواهد یافت که باعث پایین آمدن فعالیت هیدرولیتیکی شده که در نتیجه آن محدود شدن ارتباط با عناصر هیدرولیز کننده است ]۱۲[.
۲-۴-۳- جداسازی و فرایند های پایین دستی
بعد از تخمیر، توده سلولی تولید شده توسط فیلتراسیون یا سانتریفیوژ از محیط کشت مصرف شده جدا می شود و می تواند مستقیماً بعنوان یک منبع پروتئینی مصرف شوند و یا ممکن است تحت فرآیندهای دیگر مثل شستشو، شکستن سلول، استخراج پروتئین، خالص سازی و پاستوریزاسیون قرار گیرند و بعد از عملیات خشک شدن و بسته بندی به عنوان یک منبع پروتئینی مورد استفاده قرارگیرد ]۲[.
۲-۵- رآکتورهای مورد استفاده در تخمیر حالت جامد
انواع مختلف بیورآکتورها برای تخمیر حالت جامد مورد استفاده قرار می گیرند.Durand (۲۰۰۳) مروری را در مورد طراحی رآکتورها در تخمیر حالت جامد ارائه داده است ]۵۴[. به طور کلی چهار نوع رآکتور در فرآیندهای تخمیر حالت جامد مورد استفاده قرار می گیرند که شامل رآکتورهای سینی دار، آکنده، استوانه ای دوار و بستر سیال می باشد ]۵۵[.
۲-۵-۱- رآکتورهای سینی دار
رآکتورهای سینی دار ساده ترین رآکتورهای تخمیر حالت جامد برای کاربردهای تجاری محسوب می شوند. این رآکتورها معمولا شامل سینی های کم عمقی به همراه سوبستراهای تخمیری می باشند که توسط میکروارگانیسم ها تلقیح شده است (شکل۲-۶). سطح بالای سینی ها در معرض هوا قرار دارد. سطح پایینی معمولا سوراخ می شود. رطوبت با اسپری کردن آب یا محلول استریل شده به درون محفظه کنترل شده و بنابراین در یک سطح بهینه نگه داشته می شود. در کاربردهای صنعتی رایج تخمیر حالت جامد معمولاً از این نوع رآکتورها استفاده می کنند، چون این نوع رآکتور ساده ترین نوع رآکتور بوده و دانش ها و تجربیات فراوانی در این زمینه موجود است. می توان با اضافه کردن تعداد سینی ها، فرآیندهای تولید در مقیاس بالا را با این بیورآکتورها انجام داد. نمونه های تجاری بیورآکتورهای سینی دار را می توان در صنایع تولید پنیر و آنزیم ها (سلولاز و پروتئاز) مشاهده کرد. از مزایای این بیورآکتورها می توان به ساده بودن آن اشاره کرد و اینکه در طول فرایند نیاز به هیچ گونه کنترل دستی نمی باشد. مشکلاتی در این نوع رآکتورها وجود دارد که مهم ترین آن بالا بودن حرارت است. همچنین نبود اکسیژن کافی و غلظت بالای دی اکسید کربن از دیگر مشکلات آن است. این مشکلات بیشتر در لایه های زیرین سوبسترای روی سینی ها اتفاق می افتد که باعث مهار رشد میکروبی می شود. به همین دلیل گفته می شود که تولید محصول در لایه های سطحی سینی ها بیشتر رخ می دهد. حذف حرارت در سینی ها عمدتاً بستگی به هدایت از طریق دیواره های سینی ها به هوا دارد. مشکلات دیگر شامل خطر آلوده شدن و بازده پایین استفاده از سوبسترا که در نتیجه شارهای کم حرارتی و جرمی بوجود می آید می باشد. این بیورآکتورها می توانند بدون هوادهی اجباری باشند یا اینکه در آن ها از هوادهی اجباری استفاده شود ]۵۷,۵۶[.
شکل ۲-۶: شماتیکی از یک رآکتور سینی دار] ۵۵[
۲-۵-۲- رآکتورهای آکنده
یک بیورآکتور آکنده برای تخمیر حالت جامد، شامل ستونی با یک پایه سوراخدار به منظور هوادهی اجباری است. این بیورآکتور ممکن است دارای پوششی برای کنترل دما طی فرایند تخمیر باشد (شکل ۲-۷). در این رآکتورها چون هوا از میان بستر پمپاژ می شود، انتقال جرم جابجایی اجباری اتفاق میافتد. کاهش تخلخل بستر با گذشت زمان یکی از مشکلات این رآکتورهاست. کار کردن با این رآکتورها به عنوان رآکتورهای پیوسته مشکل است و با کیکی شدن بستر در ستون ها، سروکار داشتن با جامد دشوار می گردد ]۵۵[.